摘要本研究旨在檢測仔豬免疫豬偽狂犬病活疫苗“喜可凈”（Bartha K61 株）后，抵抗偽狂犬病病毒變異株攻擊的保護效果。材料與方法：取4～6 周齡PRV 抗體陰性仔豬，肌肉注射接種配以A3 或RED稀釋液的“喜可凈”疫苗，一周后用豬偽狂犬病病毒變異株（AH02LA 株）進行攻毒。測定免疫后抗體陽轉(zhuǎn)狀況，檢測攻毒后臨床癥狀、直腸溫度、鼻腔排毒和肺部病變。

實驗結(jié)果：疫苗免疫組豬只（“喜可凈”+A3 稀釋液或“喜可凈”+RED 稀釋液）在免疫后7 天均可以檢測到偽狂犬病病毒gB 的抗體。攻毒對照組豬只攻毒后3天出現(xiàn)體溫持續(xù)升高，打噴嚏，鼻腔流出膿性分泌物，攻毒5天后出現(xiàn)呼吸困難，共濟失調(diào)等癥狀，5～7天出現(xiàn)死亡，發(fā)病率為100 %，死亡率為60%，所有豬只鼻拭子均檢出排毒，持續(xù)時間為1～5天，排毒量最高達103.875TCID50/0.1mL，所有豬只肺部均有出血、淤血等病變。兩個免疫組的豬只攻毒后，所有豬只均未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。“喜可凈”+RED 稀釋液組有4頭豬只鼻拭子檢測到排毒，其中2頭僅持續(xù)1天，另2頭持續(xù)3天，排毒的滴度均低于101.125TCID50/0.1mL。“喜可凈”+A3 稀釋液組僅有3 頭豬只檢出排毒，持續(xù)時間均未超過1 天，排毒滴度均低于100.25TCID50/0.1mL。所有免疫豬只肺部未見明顯病變。

結(jié)論：使用豬偽狂犬病活疫苗“喜可凈” 對仔豬一次免疫后7 天，能夠快速產(chǎn)生免疫應答，可以抵御偽狂犬病病毒變異株攻擊，盡管少部分豬只出現(xiàn)排毒，但持續(xù)時間縮短，排毒強度顯著減弱；此外，“喜可凈”配以A3 稀釋液能提供更好的保護效果。豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒引起的一種急性傳染病，母豬發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)木乃伊、死胎和病弱仔豬，初生仔豬癥狀嚴重，主要表現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)障礙，發(fā)病仔豬呼吸急促或呈腹式呼吸，出現(xiàn)肌肉震顫，步態(tài)失衡，后期肌肉痙攣，四肢麻痹，常見有病豬臥地后四肢呈劃水狀。通常情況下，隨著日齡增大，癥狀有所減輕，斷奶后的仔豬常不顯癥狀或僅見輕微癥狀，成年豬大多為隱性感染。以前雖然有報道斷奶后仔豬發(fā)生偽狂犬病出現(xiàn)發(fā)熱和神經(jīng)癥狀并死亡的病例，但多屬個案，沒有發(fā)生大規(guī)模流行。而2011 年以來，在我國的大部分地區(qū)爆發(fā)了一輪豬偽狂犬病疫情，此輪疫情與以住不同的突出特點是斷奶仔豬的發(fā)病亦很嚴重，有時架子豬和育肥豬也出現(xiàn)典型呼吸道病癥，疫情過后許多曾經(jīng)的偽狂犬病病毒陰性的豬場重新變?yōu)殛栃詧觯瑢ξ覈B(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失。對此輪疫情的研究發(fā)現(xiàn)，一種毒力顯著增強且傳染力也很強的流行毒株的出現(xiàn)是主要原因，流行株的主要保護性抗原基因gB、gC 和gD 基因與以前報道的毒株相比發(fā)生了基因的插入或缺失以及點突變，是一種變異株，被劃分為基因II 型譜系。對此次突發(fā)疫情的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，此前我國許多豬場因成功實施偽狂犬病凈化計劃而停止注射豬偽狂犬病疫苗，造成豬群的易感性強，是引起爆發(fā)流行的又一重要原因。在疫情發(fā)生后，規(guī)模化豬場加強了豬偽狂犬病疫苗的免疫，絕大部分豬場發(fā)病勢頭得到了有效遏制，但豬群的PRV gE 抗體陽性率居高不下，使人們對現(xiàn)有豬偽狂犬病疫苗能否保護豬只對變異株的感染產(chǎn)生懷疑，本研究應用豬偽狂犬病活疫苗“喜可凈”（Bartha K61 株）免疫PRV 陰性仔豬，檢測其能否抵抗偽狂犬病病毒變異株的攻擊。

1 材料與方法1.1 材料1.1.1 試驗材料豬偽狂犬病活疫苗“喜可凈”（Bartha K61 株），西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批次為66HP。偽狂犬病病毒變異株AH02LA 株，F(xiàn)2，TCID50 是 10-7.25/0.1mL ，由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離鑒定，制備批號為20141009，-70℃保存。疫苗稀釋液：RED 稀釋液和A3 稀釋液均由西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)，RED 稀釋液批次為 025-14-2，A3 稀釋液批次為09SM-1。檢查偽狂犬病病毒抗體試劑盒由西班牙海博萊生物大藥廠提供，PRV gE 抗體診斷試劑盒，批次為CAE.68YC，PRV gB 抗體診斷試劑盒批次為CAB.73VS。BHK-21 細胞來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)查所（CL6），在本室傳代擴繁。DMEM 和犢牛血清、胰酶購自Gibco公司。1.1.2 試驗動物試驗用4～6 周齡健康仔豬均來自散養(yǎng)農(nóng)戶，種豬或仔豬均未進行豬偽狂犬病疫苗接種，品種為二元或三元雜交豬，檢測PRVgB 和gE 抗體均為陰性。

1.2 方法1.2.1 試驗設計與分組試驗中，選取PRV 抗體陰性仔豬20 頭，隨機分為4 組，每組5 頭。A 組：用“喜可凈”+A3 稀釋液進行肌注免疫，每頭豬注射1 頭份，2ml/頭份。B 組：用“喜可凈”+RED 稀釋液進行肌注免疫，每頭豬注射1 頭份，2ml/頭份。C 組：攻毒對照，肌肉注射PBS，2ml/頭。A、B 和C 組在免疫后7 天應用變異株（AH02LA株）攻毒。D 組：空白對照組，肌肉注射PBS，2ml/頭，不攻毒（表1）。 1.2.2 攻毒方法與觀測指標免疫后觀察豬群的臨床癥狀。在免疫前和免疫后 7 天兩個時間點，采集試驗豬只血清，通過阻斷ELISA 實驗檢測偽狂犬病病毒gB 和gE 的抗體。A 組、B 組和C 組實驗豬只免疫7 天后，通過鼻腔攻毒變異毒株AH02LA (攻毒劑量為107.1TCID50/mL, 2mL/dose)，攻毒后，每天檢查每頭豬只體溫和臨床癥狀，并且檢測鼻腔排毒情況，鼻拭子樣品的采集與病毒分離和滴度測定方法參考文獻報道，主要步驟為取鼻拭子樣品，置入含300U/mL 青霉素和300μg/mL 鏈霉素的PBS1mL 中，經(jīng)充分震蕩后，在-70℃凍融一次，10000RPM 離心10 分鐘，取上清接種于BHK-21 細胞測定病毒的TCID50（Karber 法）。攻毒后14 天，剖殺所有豬只檢查肺部病變情況。2 試驗結(jié)果 免疫前，所有試驗動物飲食、精神正常，無臨床癥狀，沒有檢查到抗偽狂犬病病毒 gB 或gE 的抗體（表2）。試驗整個過程中，空白對照組（D 組）所有豬只均臨床表現(xiàn)正常（表3），無發(fā)熱反應（圖1），鼻拭子未檢測到排毒（表4），試驗結(jié)束剖檢所有豬只肺部無明顯病變（表5）。攻毒對照組（C 組）在攻毒前，所有豬只偽狂犬病病毒 gB 或gE 抗體均為陰性（表2），攻毒3 天后開始，所有豬只體溫陸續(xù)升高到40.5℃以上，最長持續(xù)達7 天（圖2 ）。對照組所有豬只出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，咳嗽，打噴嚏和流出化膿性鼻分泌物，攻毒5 天后豬群出現(xiàn)呼吸困難，共濟失調(diào)，驚厥，在攻毒后第5天和第6 天分別死亡2 頭和1 頭，存活下來的仔豬生長緩慢（表3）。所有豬只在攻毒后第2 天或第3 天均能從鼻拭子檢出排毒，持續(xù)時間3～5 天，排毒量最高達103.875TCID50/0.1mL（表4）。病死豬只或攻毒后14 天剖殺豬只的肺部均可見有明顯的出血或淤血病變（表5）。“喜可凈”+RED 稀釋液組（B 組）和“喜可凈”+A3 稀釋液組（A 組）在接種疫苗后7 天，所有豬只偽狂犬病病毒 gB 抗體均為陽性，gE 抗體均為陰性（表2）。攻毒后所有豬只均未見有明顯的臨床癥狀（表3）, 無體溫升高（圖1）。“喜可凈”+RED 稀釋液組（B 組）有4 頭豬只鼻拭子檢測到排毒，其中2 頭僅持續(xù)1天，另2 頭持續(xù)3 天，排毒的滴度均低于101.125TCID50/0.1mL（表4）。“喜可凈”+A3 稀釋液組（A 組）僅有3 頭豬只檢出排毒，持續(xù)時間均未超過1 天，排毒滴度均低于100.25TCID50/0.1mL，降低的幅度更加明顯（表4）。試驗結(jié)束剖檢所有豬只肺部無明顯病變（表5）。與攻毒對照組（C 組）相比，“喜可凈”+A3 稀釋液組（A 組）“喜可凈”+RED 稀釋液組（B 組）的排毒持續(xù)時間大幅縮短，排毒量顯著降低（圖2）。3.結(jié)論與討論病毒在人工或自然傳代的過程中發(fā)生基因序列的變異是一種自然現(xiàn)象，皰疹病毒是DNA 病毒，相對而言，其發(fā)生變異的概率較低，盡管有時在免疫壓力下，經(jīng)過一定時間后會出現(xiàn)流行株毒力增強的情況，例如雞馬立克氏病病毒，其流行野毒株的毒力不斷增強，但其血清型并沒有發(fā)生改變，疫苗仍能提供足夠的保護力。2011 年以來在我國流行的豬偽狂犬病疫情已被證實是由一種變異株引起的，變異株對豬的致病力和在豬只之間的傳播力明顯增強，對其基因序列分析表明，其與經(jīng)典的PRV 毒株差異明顯，可以歸為一種新的基因型，即基因II 型，而經(jīng)典株歸為基因I 型，但其血清型沒有發(fā)生顯著改變，提示經(jīng)典株的疫苗仍能對變異株產(chǎn)生有效保護。本研究用海博萊豬偽狂犬病活疫苗“喜可凈”免疫沒有偽狂犬母源抗體的仔豬一周后，再用致死量PRV 變異株（AH02LA 株）強毒來攻毒，結(jié)果表明兩組免疫組豬只對攻毒仍有完全的臨床保護，沒有體溫升高，沒有臨床癥狀。而仇華吉課題組（2014）報道， Bartha K61 株免疫一周后攻毒時3 頭豬有2 頭觀察到有發(fā)熱，精神不振和減食等癥狀，疫苗對仔豬的臨床保護是不完全的。這些差異可能是疫苗生產(chǎn)所用的Bartha K61 株的培養(yǎng)條件不同，疫苗所用的稀釋液不同，疫苗抗原含量不同等引起。此試驗結(jié)果證明了Bartha K61 株對變異株的臨床保護能力，也為2011 年以來田間生產(chǎn)反復觀察到的緊急免疫依然有效，陽性場在Bartha K61 株的控制下無臨床癥狀等現(xiàn)象提供了實驗依據(jù)。A3 稀釋液是一種含有免疫增強劑左旋咪唑和樹脂等的新型稀釋液，左旋咪唑和樹脂被廣泛使用在新型疫苗的佐劑中，能夠更快、更強地激發(fā)機產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。本試驗結(jié)果表明，相對于對照組，喜可凈免疫組在攻毒后2 周內(nèi)，仔豬排毒持續(xù)時間和排毒的量都顯著降低；且A3 比RED 稀釋液更勝一籌。在田間情況下，如此少量的短期排毒，對多次免疫的豬群，能否有效感染還待進一步試驗。此試驗結(jié)果提示Bartha K61 株對變異株造成的偽狂犬陽性場再次轉(zhuǎn)陰提供了可能，也為2011 年以來田間生產(chǎn)反復觀察到的陽性場在Bartha K61 株控制下再次轉(zhuǎn)陰提供了實驗依據(jù)。

此外，本試驗也重復觀察到了《豬病學》等文獻對偽狂犬疫苗的一慣性描述，即偽狂犬疫苗不能徹底阻止感染豬只排毒，所以，凈化豬偽狂犬病，還需要同時從其他方面進行配合。眾所周知，在傳染病的防控中，清除傳染源、切斷傳播途徑和保護易感動物是關(guān)鍵的三要素。本次試驗和大量田間數(shù)據(jù)表明，現(xiàn)有疫苗仍能很好地保護易感動物。但是，陽性豬群不做淘汰，構(gòu)成豬場的永久的傳染源；一點式和連續(xù)生產(chǎn)的傳統(tǒng)飼養(yǎng)模式無法有效切斷偽狂犬病病毒的傳播途徑，這些都是造成目前陽性場轉(zhuǎn)陰困難或者陰性場突然轉(zhuǎn)陽的重要原因。

值得注意的一點是，自2011 年的偽狂犬流行到目前為止，各省陽性場率差別較大，發(fā)病早的區(qū)域仍然是陽性場居多，轉(zhuǎn)陰難度大；有些區(qū)域的陰性場仔豬免疫一次（甚至一次不免）也能保持陰性，而有些區(qū)域的陰性場仔豬免疫2 次或者更多仍不免轉(zhuǎn)陽；這些現(xiàn)象提示各豬場內(nèi)和各地區(qū)野毒感染壓力的不同。其實，判斷一個場是否是真正陰性場，是否能長期保持陰性，除了做好生物安全，優(yōu)化生產(chǎn)流程，合理接種疫苗，還要同時看該場所在區(qū)域是否是陰性區(qū)域。毋庸置疑，啟動區(qū)域性凈化，降低一個地區(qū)的偽狂犬病病毒感染壓力對于降低各場凈化難度，保持長期陰性是非常重要。反之，面對新的疫情，如果我們依然只是采取規(guī)模豬場進行本場內(nèi)部的偽狂犬凈化，或者只是對種豬場進行凈化，而對商品豬以不發(fā)病為目標，我們的凈化成果是很難有保障的。正如歐美多國豬偽狂犬病凈化經(jīng)驗表明，疫苗的使用只是其中一個環(huán)節(jié)，啟動區(qū)域性凈化，對商品豬和種豬同時凈化，才是偽狂犬凈化正確的方向。（完）