一、國內外食品（農產品）安全農藥殘留混合污染現狀

近年來，我國農藥的品種、產量及使用量劇增，特別是生產者在農業生產過程中混合施用多種農藥的現象增多，造成農產品中出現多種農藥殘留。我國現有的農藥殘留最大限量標準僅規定單一農藥殘留的限量，而食品和農產品中常常存在多種農藥殘留共存于單一產品的混合污染，如蔬菜上可能殘存多種農藥形成“農藥雞尾酒”現象，導致無法對產品中混合污染物的聯合毒性效應作出科學研判，給農產品質量安全和食物消費帶來了風險隱患。

食品中農藥殘留聯合效應風險評估成為近年來國際關注的焦點和研究熱點。根據近年歐盟食品中農藥殘留風險監測結果，有超過26％的食品中含有多種農藥殘留，其中1/3的樣品含有4種以上的農藥殘留，單個產品中最多含有8種農藥殘留。因此，消費者在食品消費過程中面臨著多種農藥殘留同時暴露的風險。美國是最早通過立法關注多種農藥殘留累積性風險評估的國家，1996年頒布的《食品質量保護法》要求對食品、水及環境等途徑中的多種農藥殘留開展風險評估。美國對有機磷類、氨基甲酸酯類、三嗪類和除蟲菊酯類殺蟲劑等農藥進行了多殘留風險研究，制定了多殘留風險評估技術體系和框架，并用于指導農藥殘留限量標準的制修訂。2000年以來，美國環境保護署（USEPA）發布了食品、飲用水等途徑的有機磷類殺蟲劑的累積性風險評估報告，指出了多種農藥之間存在濃度相加的聯合風險效應。歐盟法規（EC）396/2005規定在制定農藥最大殘留限量標準時應考慮多種農藥殘留的協同效應，并采用累積性風險評估方法開展多種農藥的安全性評價。歐盟食品安全局（EFSA）2008年發布了開展食品中多種農藥殘留風險評估的科學意見，并用于指導農藥最大殘留限量值的制定。近年來EFSA發布了食品中有機磷類、氨基甲酸酯類殺蟲劑、三唑類殺菌劑等農藥殘留累積性風險評估報告。

二、動物體內試驗在農藥殘留混合污染聯合效應評估中的應用

動物體內試驗是毒理學的基本研究方法。傳統的化學物毒性測試依賴整體動物，實驗多采用哺乳動物，體內試驗結果原則上可外推到人。因此，動物體內試驗在混合污染聯合效應評估中得到了廣泛應用。Hass等利用大鼠體內試驗研究了乙烯菌核利、氟他胺、腐霉利3種具有抗雄激素效應的農藥對雄性大鼠生殖發育毒性的影響。研究發現，以肛門生殖器距離（AGD）作為毒性終點時，3種農藥的聯合作用基本符合劑量加和，而觀察到的乳頭保留（NR）結果略高于基于劑量加和的預測。將在單個農藥作用條件下沒有誘導AGD產生顯著變化的劑量進行3種農藥的混合，結果混合物能夠產生AGD改變最高值一半的效果；在農藥單獨作用時只能產生NR效應很小的改變，而農藥混合物能使雄性大鼠的乳頭保留趨近雌性大鼠的性征。

代謝組學作為一種對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的新興研究手段，可以全面地反映中毒后生物體內代謝物的變化，獲得豐富的生物標志物信息，從一個新角度揭示毒性作用機制，因此在混合污染物安全性評估領域也得到了應用。中國科學院動物研究所伍一軍團隊利用代謝組學技術，重點針對有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類殺蟲劑，研究了農藥殘留的聯合毒性效應，發現馬拉硫磷、抗蚜威分別與敵敵畏染毒后可影響小鼠肝臟的糖代謝、脂肪代謝和氨基酸代謝，并引起肝臟損傷；抗蚜威和敵敵畏等毒性復合染毒對肝臟功能相關代謝物的影響較兩種農藥單獨作用時顯著；馬拉硫磷與敵敵畏復合染毒對肝臟功能相關代謝物的影響較馬拉硫磷單獨作用時相近；敵敵畏與抗蚜威、敵敵畏與馬拉硫磷對肝臟的代謝功能的影響沒有相互作用。

三、體外試驗在農藥殘留混合污染聯合效應評估中的應用

體外試驗是利用游離器官、培養的細胞或細胞器進行毒理學研究，其中以細胞毒性測試技術為代表的實驗動物替代方法的發展與應用已成為毒性測試的重要方向，獲得越來越廣泛的支持和管理認可，具有廣闊的發展前景和重要的應用價值。法國國家食品安全、環境及勞動局（ANSES）對近年來法國果蔬消費中的農藥殘留及其混合污染物進行了監測，并利用人體細胞系對典型農藥殘留混合物進行了評估，對細胞活力進行了測定。研究了7組農藥混合物對肝癌細胞系（HepG2）和結腸癌細胞系（Caco-2）的毒性，這7組混合物由2～6種農藥組成，在蔬菜和水果監測中暴露水平較高。將測定結果同基于單一毒性和混合物聯合毒性的預測結果進行比較，進而估計細胞毒性最強的兩組組合。對于DDT和狄氏劑組合，等摩爾混合物的細胞毒性強于單一毒性和混合物聯合毒性的預測結果。此外，等摩爾混合物導致的細胞凋亡率高于兩者單獨作用之和。因此，法國果蔬消費中的部分“農藥雞尾酒”組合產生了協同作用。此外，考慮到農藥對孕烷X受體（PXR）的轉錄激活和目標基因（細胞色素CYP3A4）表達的影響，ANSES還對這7種“農藥雞尾酒”對細胞DNA的損傷、氧化應激、細胞凋亡和PXR核酸受體（細胞色素CYP3A4的轉錄調節因子，調節外源化學物質的代謝）的效應進行了研究，發現了具有細胞毒性效應的雞尾酒組合，部分結果與濃度相加的預測結果產生了偏離。Christen等測定了有機磷類殺蟲劑和吡咯類殺菌劑的聯合抗雄性激素效應。在人乳腺癌細胞（MDA-kb2）模型中，無毒性效應濃度的各單劑和多種農藥的混合物作用于細胞后，農藥聯合作用效果符合劑量相加作用，高濃度藥物處理細胞時表現出協同作用，低濃度時為拮抗作用。吡咯類殺菌劑表現出了較強的抗雄性激素效應，符合相加作用和協同作用的比例各占一半。

四、生態毒理學方法在農藥殘留混合污染評估中的應用

在生態毒理學領域，通常利用魚類、植物藻、大型溞等水生生物，或蚯蚓、線蟲、發光細菌等生物對化學物進行毒理學評估。混合物的研究對象主要是從特定類型的化學物中選擇，而針對具有不同作用機制或不同類型化學物的組分組成的復雜混合物的研究則較為少見。Faust以植物藻為模式生物，開展了16種化合物混合物的研究，所有化合物都與藻類的不同靶器官作用。當這些化合物以6.6％～66％的NOECs劑量混合時，可觀測到18％的聯合效應。Zhang等以毒物對青海弧菌Q67發光抑制為毒性指標，考察了馬拉硫磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷等6種有機磷殺蟲劑的聯合效應，該方法具有靈敏度高、相關性好、反應速度快等優點。結果發現二元混合物大多服從相加作用。中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所錢永忠研究員帶領的科技創新團隊以毒死蜱、丁草胺、高效氯氟氰菊酯等不同種類農藥殘留組成的混合污染物為研究對象，利用酶活力、急性毒性等毒性終點測定了二元、三元及多元農藥殘留混合物的聯合毒性效應。二元混合物整體表現出濃度相加的聯合作用特點，也有部分組合偏離了濃度相加或獨立作用，但偏離系數一般在2以內；三元農藥殘留混合物在不同濃度水平呈現不同的聯合毒性效應，并隨急性毒性的增加而增強；多元農藥殘留混合污染呈現出顯著的協同作用，并隨混合物復雜性的增加而增強。一方面，混合污染物的聯合毒性效應由各組分的毒性作用機制決定，但是這些組分作用于環境中的非靶標生物時，其作用機制可能改變并變得未知。另一方面，聯合毒性效應還受到毒性效應水平的影響，導致聯合作用方式在不同效應水平下變得復雜，而不再與各組分的作用機制有明顯的相關性。此外，針對不同物種開展的同一混合物的毒理學測定可能會表現出不同的反應，并隨著混合物組分的復雜性增加，聯合效應趨向于顯著的協同作用。研究結果表明，農藥殘留混合污染物的聯合毒性效應廣泛存在，僅考慮單一物質的毒性效應容易低估真實的風險水平，可為農藥殘留聯合毒性效應評價及混合污染風險評估提供基礎數據和科學依據。

五、混合污染物聯合毒性效應判定研究進展

混合物毒理學的主要內容是根據各個組分的毒性信息來定量預測混合物毒性，前提是假設各組分之間沒有相互作用。濃度（劑量）相加（ConcentrationAddition，CA）和獨立作用（Independent Addition，IA）是最為常用的兩種混合物聯合毒性判定方法。

（一）濃度（劑量）相加

CA的理論基礎是混合物的各組分作用機制相同，組分之間互為稀釋物。如果這些物質的作用位點是同一個分子靶標，則一種組分可用等效應的另一種組分來代替，而不會改變混合物的毒性。CA模型的計算方程為：ECx，mix 表示誘導x％效應時混合物的濃度，ECx，i代表其中的組分i單獨作用達到x％效應的濃度，pi是指組分i在混合物中相應的質量比例。

根據這種假設，將等毒性的物質濃度進行簡單相加，即可得出混合物的毒性。該方法成功地預測了多種農藥的聯合毒性效應。

Altenburger研究了137種由不同農藥組成的二元混合物，得出CA在觀測毒性數據的整體預測性更好的結論。Faust也得出了類似的結論，即盡管所有混合物都是由除草劑和殺蟲劑或除真菌劑組成，38個二元農藥混合物中66％的組合可使用CA預測。Deneer重新評估了202個農藥混合物的實驗結果，發現在90％以上的情況下，CA可以準確評估混合物的聯合毒性，且偏差不超過2倍。Warne認為75％～80％重新評估的混合物可使用CA準確評估，但其余20％～25％則存在偏差。只有5％的混合物使用CA評估的結果與實驗觀測結果有2.5倍的偏差，僅有1％的實驗結果與CA預測值偏差超過5倍。

（二）獨立作用

IA利用混合物中各組分的單一效應來計算聯合毒性，根據統計學上獨立事件發生的概率得出聯合效應。單一組分在低于效應水平時，將不會對聯合效應產生貢獻。如果所有的組分都低于效應水平，則聯合效應為零。IA模型的計算方程為：c mix和E(c mix) 分別表示混合藥物的總濃度和總效應。E（c i）代表其中的組分i在混合藥物中的濃度為c i時的效應。

在同一個研究中同時采用兩種方法的報道中，在大部分情況下，IA方法預測的混合物效應中濃度（如EC50值）通常比用CA方法的結果高數倍，后者顯得更為保守。Belden在2007年發表的大樣本研究中包括了37個應用IA預測聯合效應的實驗，預測與觀測的混合物毒性比率通過模型偏差率（MDR）表達。IA方法在預測具有不同作用機制農藥的混合物時，其結果更為準確，但在大多數情形下與CA方法的預測結果相差很小。根據獨立作用原理，100種能夠單獨產生1％效應的化學物質的聯合效應值為63％；如果這100種化合物的單獨效應為0.1％，聯合效應值為9.5％。但是當混合物的組分過多時，對于各組分零效應和低效應對應劑量水平的準確區分非常困難。

六、農藥殘留混合污染聯合效應評估研究展望

EFSA目前已經完成的評估主要側重于同一個類別或者具有相同作用機制的化合物（如有機磷類、氨基甲酸酯類殺蟲劑和三唑類殺菌劑），不考慮組分之間的相互作用，也稱累積性風險評估。食物消費過程中的農藥殘留可以是不同類別組分的混合物，因此這些情況還不足以反映農藥殘留的真實狀況。2013年之前，EFSA的植物保護產品及殘留（PPR）科學小組發布過3份相關的科學意見。2008年，PPR科學小組邁出了累積性風險評估的第一步，起草了針對現有累積性風險評估方法實用性和可行性的科學意見，提出了根據農藥結構、作用機制及毒性效應，將食品中各種農藥劃分到累積性評估組（CAG）的準則，認為具有共同作用機制的農藥可利用劑量相加方法預測其累積性效應。隨后，PPR小組根據食品中三唑類殺菌劑的典型案例，對2008年提出的累積性風險評估方法進行了驗證，發布了食品中三唑類殺菌劑累積性風險評估的科學意見。為了繼續完善食品和飼料中農藥殘留限量設定過程中的累積性風險評估，2013年該小組進一步提出了如何根據農藥的毒理學資料建立CAG評估組的詳細方法與準則。該科學意見認為，食品中的各種具有不同作用機制農藥，可能對同一靶器官產生共同的毒性效應，因此其累積性毒性效應可借助于CA方法進行初步預測，這一方法適用于農藥MRL設定過程或者實際暴露情形下的累積性風險評估。PPR小組建議，今后應進一步優化CAG小組的劃分準則，收集農藥的毒理學登記資料，加強農藥毒性作用途徑研究。同時，收集農藥在哺乳動物中的劑量－反應關系評估結果，進一步檢驗IA方法在哺乳動物測試系統中的適用性及其保守程度。

2007年美國國家研究院（NRC）發表了《21世紀毒性測試：遠景與策略》報告。該報告為未來毒性測試的發展提供了策略，未來的毒性測試的重點將由整體動物試驗轉向基于人類細胞、細胞系和/或細胞組分等實驗動物替代方法的測試策略。毒性測試的主要內容包括化學物的特性分析、含毒性通路和靶向測試的毒性測試以及劑量－反應與外推模型的研究，通過這些研究進一步開展外源性化合物的危險度評價和人群暴露分析。毒性測試的重點關注因素包括敏感檢測終點的選擇與評價、細胞－反應網絡、高通量與中通量方法的構建與應用、作用機制與作用模式、毒性通路以及系統生物學效應等，著力實施高通量、高靈敏度、低成本、預測能力強而且準確的毒性測試策略。因此，未來的毒性預測將主要依賴于體外試驗和基于計算機模型，傳統動物試驗將可能被部分替代甚至完全替代。

隨著體外毒性測定技術的發展，美國環保署（EPA）、國立衛生研究院（NIH）等機構合作，迅速啟動了一個重大研究計劃——21世紀毒理學計劃（TOX21）。TOX21借助高通量的自動化機器人設備，通過一系列的毒性通路，研究環境中的復雜化學物對人體細胞的影響。TOX21的目標是研究、建立、驗證新興的測試方法來發現毒性通路，確定需要進一步評價的化學物的優先序。同時，該計劃著力于尋找、發現化學物的毒性作用機制，來表征毒性通路的效應，促進物種間差異和向低劑量水平的外推，建立人類生物學效應的評價工具。目前，該計劃的第一階段高通量測試已經完成，包括11000種化學物。涉及的毒性測試終點包括細胞凋亡、細胞活力、DNA損傷、線粒體毒性、核酸受體效應，以及各種通路效應等。該計劃的其他要素還包括利用斑馬魚、線蟲等模式生物和3D體外細胞系（皮膚、肺、腎臟）作為測試對象的補充，并借助于生物信息學手段對測試結果進行分析。TOX21的評估結果將作為今后化學物毒性優先評價的重要依據。

作者：錢永忠，系中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所研究員；陳晨，系中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所助理研究員。